Практические врачи ожидают от специалистов-микробиологов объективных данных о чувствительности выделенных микроорганизмов к антибиотикам, так как некачественно выполненное бактериологическое исследование ведет к нерациональному (ошибочному) назначению антибиотиков, ухудшению исхода болезни, увеличению длительности госпитального лечения, а также к увеличению стоимости лечения и диагностических процедур.
Из всех методов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам наиболее распространенным является диско-диффузионный метод (ДДМ). Метод широко распространен, технологически доступен, гибок (возможно определение чувствительности бактерий только к тем антибиотикам, которые требуются в конкретной клинической ситуации), воспроизводим при соблюдении условий тестирования и приготовления расходных материалов.
Однако следует отметить, что в большинстве российских ЛПУ, при использовании ДДМ допускаются серьезные нарушения требуемых условий его выполнения, что приводит к получению ошибочных результатов определения чувствительности и назначению нерациональной антибиотикотерапии (со всеми вытекающими клинико-экономическими последствиями).
К типичным источникам ошибок при определении чувствительности микроорганизмов ДДМ можно рассматривать причины, связанные:
1) с агаром, используемым для определения чувствительности;
2) с дисками, содержащими антибиотики;
3) с бактериальной суспензией;
4) условиями тестирования.

I. Питательная среда
Агар, используемый для определения чувствительности ДДМ, должен соответствовать определенным требованиям. Он должен поддерживать хороший рост всех быстрорастущих организмов, иметь стабильную рН и стандартное содержание различных компонентов. Среда (агар) не должна влиять на активность антибиотика, а диффузия антибиотика в агар должна быть равномерной. Осмотическое давление среды не должно изменяться при добавлении крови или других добавок. Различные партии агара должны давать воспроизводимые результаты.
Особенности среды АГВ
Обычно в большинстве российских лабораторий для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам используют отечественную среду АГВ (агар Гивенталя-Ведьминой). Однако среда АГВ имеет ряд особенностей, ограничивающих её применение для тестирования ДДМ.
1. Существующая вариабельность рН разных партий агара может приводить к неправильным результатам определения чувствительности к ряду антибиотиков, таких как аминогликозиды, макролиды и линкомицин.
2. Среда АГВ не стандартизирована по содержанию двухвалентных катионов кальция, магния и цинка, что обусловливает ошибки при тестировании Рseudomonas aeruginosa к аминогликозидам, фторхинолонам и имипенему. Некоторые нечувствительные клинически значимые штаммы P. aeruginosa на среде АГВ могут быть ошибочно оценены как чувствительные, что приводит к недооценке резистентности к антимикробным препаратам.
3. Среда АГВ не стандартизирована по содержанию тимина и тимидина. В связи с этим она непригодны для определения чувствительности всех бактерий к сульфаниламидам и триметоприму.
4. Среда АГВ отличается низкой способностью поддержания роста ряда микроорганизмов, что ограничивает её использование как агара-основы для тестирования Haemophilus influenzae.
5. Среда АГВ непригодны для выявления метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus spp. методом скрининга (на этой среде не растет контрольный штамм АТСС 43300 как через 24 часа, так и через 48 часов инкубации).

Для проведения исследований с помощью ДДМ необходимо
использовать агар Мюллера-Хинтон.

II. Особенности приготовления чашек с агаром для определения
чувствительности ДДМ
Для получения корректных результатов определения чувствительности ДДМ необходимо не только использовать качественную питательную среду, но и соблюдать правила приготовления чашек с агаром. Важными параметрами являются толщина и равномерность слоя агара в чашке Петри. Стандартная толщина агара в чашке должна составлять 4,5+0,5 мм, для чего в чашку диаметром 90 мм добавляют 20 мл агара, а при диаметре чашки 100 мм - 25 мл агара. С увеличением толщины слоя агара уменьшаются диаметры зон подавления роста в различной степени для разных антибиотиков, что может быть ошибочно расценено как резистентность. Напротив, при недостаточной толщине агара в чашке Петри может происходить отраженная диффузия антибиотиков от дна чашки Петри, что приводит к формированию больших зон подавления роста и является более неблагоприятным с клинической точки зрения, так как штамм может быть ошибочно оценен как чувствительный.

III. Диски с антибиотиками для определения чувствительности
Диски должны быть коммерческого производства и правильно храниться (при - 20? С) до использования.
Диски отечественного производства, а также некоторых зарубежных производителей не всегда стандартизированы, особенно содержащие цефалоспорины и карбапенемы. Кроме того, отечественные диски могут содержать концентрации антибиотиков, для которых не разработаны критерии интерпретации результатов. Вследствие этого бактериологи затрудняются оценивать результаты, получаемые при определении чувствительности микроорганизмов с помощью таких дисков.
В настоящее время в России можно приобрести качественные диски с антибиотиками только двух ведущих западных фирм - "биоМерье" (Франция) и BBL (США). Эти диски стандартизированы и содержат антибиотики в количествах, для которых разработаны критерии интерпретации.
Основные проблемы, связанные с дисками, содержащими антибиотики, возникают при неправильном их хранении или использовании. Для длительного хранения дисков необходимы морозильные камеры, поддерживающие температуру -20 ?С. Те диски, которые непосредственно используются для тестирования, можно непродолжительное время хранить в холодильнике при температуре + 4-8 ? С.
Самым важным условием является защита дисков от влаги, поскольку при её попадании снижается активность антибиотиков, что приводит к неправильным результатам определения чувствительности. Для предотвращения образования конденсата на поверхности дисков после извлечения их из холодильника перед тестированием их необходимо оставить в герметичной упаковке при комнатной температуре на 30-60 минут.

IV. Особенности использования бактериальной суспензии
Проблемы, связанные с бактериальной суспензией, можно разделить на две категории:
1) чистота исследуемого штамма;
2) гомогенность и плотность приготовленной суспензии.
Для приготовления суспензии необходимо использовать чистую суточную культуру одного штамма микроорганизма. Контаминация тестируемого микроорганизма может приводить к ошибочным результатам определения чувствительности. Плотность инокулюма должна быть эквивалентна стандарту мутности 0,5 по McFarland, что примерно составляет 1,5 х 10 х 8 КОЕ/мл. При использовании более плотной бактериальной суспензии можно получить ложную резистентность. При использовании инокулюма недостаточной плотности у тестируемого микроорганизма может быть отмечена ложная чувствительность.
Неоднородная бактериальная суспензия обусловливает неравномерный рост микроорганизма на поверхности агара, что существенно затрудняет учет полученного результата, а в некоторых случаях он бывает невозможным.

V. Режим инкубации при определении чувствительности
При определении чувствительности бактерий ДДМ необходимо соблюдать условия тестирования: атмосферу и температурный режим. Так, если во время тестирования "непривередливые" микроорганизмы инкубируют в обычной атмосфере, то при определении чувствительности таких микроорганизмов, как Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, инкубацию необходимо проводить в СО2 - инкубаторе в присутствии 5-10% СО2. Температура инкубации при тестировании должна быть 35-36?С. Непременным условием является способность термостатов постоянно поддерживать эту температуру на определенном уровне.

VI. Внутренний контроль качества определения чувствительности
Внутренний контроль качества представляет собой постоянный мониторинг качества реагентов, работы оборудования, выполнения лабораторных процедур и включает обучение персонала, разработку методических руководств, проверку качества питательных сред и т.д.
Для внутреннего контроля качества определения чувствительности в лаборатории необходимо использовать контрольные штаммы микроорганизмов, которые представляют собой генетически стабильные микроорганизмы, обладающие определенными фенотипами чувствительности. В большинстве бактериологических лабораторий используют контрольные штаммы Американской коллекции типовых культур (АТСС).
Все используемые для контроля качества микроорганизмы должны иметь соответствующую документацию, содержащую характеристику штаммов. К основному набору контрольных штаммов относятся:
- Escherichia coli ATCC 25922 - для тестирования бактерий, относящихся к семейству энтеробактерий;
- Escherichia coli ATCC 35218 - для тестирования энтеробактерий к ингибиторозащищенным бета-лактамам;
- Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 - для тестирования Pseudomonas spp. и других неферментирующих бактерий;
- Staphylococcus aureus АТСС 29213 - для тестирования Staphylococcus spp.;
- Enterococcus faecalis ATCC 29212 - для тестирования Enterococcus spp.;
- Haemophilus influenzae ATCC 49247 - для тестирования H. influenzae;
- Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 - для тестирования S. рneumoniae и Streptococcus spp.
Контрольные штаммы необходимо тестировать параллельно с определением чувствительности клинических изолятов. Тестирование контрольных штаммов проводят вначале ежедневно, затем, при получении корректных результатов, в течение 30 последовательных дней. Допустимо еженедельное тестирование.
Кроме того, необходимо тестирование контрольных штаммов при получении новой партии агара или новой партии дисков с антибиотиками.
При определении чувствительности контрольных штаммов диаметры зон подавления роста должны попадать в определенные диапазоны, которые указаны в таблицах используемых стандартов. Если при тестировании контрольных штаммов диаметры зон подавления роста попадают в допустимый диапазон, то результаты определения чувствительности клинических штаммов можно считать корректными и использовать для выбора антибактериальной терапии. В противном случае необходимо выяснить причину получения ошибочного результата и повторно определить чувствительность контрольного и клинических штаммов.
Определенными ориентирами для выяснения причин получения некорректных результатов могут служить следующие ситуации. Если при тестировании контрольного штамма все диаметры зон подавления роста микроорганизмов на одной чашке Петри не попадают в допустимые диаметры, то это может быть обусловлено плохим качеством агара или нарушением процедуры приготовления чашек с агаром (толщина агара больше или меньше допустимой, неровная и/или неоднородная поверхность), использованием нестандартизированных дисков с антибиотиками, а в редких случаях - изменением свойств самого контрольного штамма.
При получении некорректных результатов тестирования чувствительности только к одному антибиотику причиной, как правило, является нестандартное содержание антибиотика в диске. Причиной может быть также особенность используемой среды, например, при определении чувствительности синегнойной палочки к аминогликозидам на среде АГВ.

Заключение
Диско-диффузионный метод определения чувствительности бактерий к антибиотикам, несмотря на свою простоту и доступность, имеет ряд особенностей, которые необходимо хорошо знать и учитывать в работе. Гарантией получения корректных результатов при тестировании являются подготовленность медицинского персонала и обязательное проведение внутреннего контроля качества.
Использование качественных материалов, точное выполнение всех лабораторных процедур и совершенствование навыков клинической интерпретации результатов тестирования обеспечат получение достоверных данных о чувствительности микроорганизмов, необходимых для выбора адекватной антибактериальной терапии пациентов с инфекционными заболеваниями.
Однако необходимо иметь в виду, что тестирование ДДМ не дает достоверных результатов при определении чувствительности S. pneumoniae к цефалоспоринам, ампициллину, амоксициллину и карбапенемам (даже при использовании агара Мюллера-Хинтон).

Наиболее вероятная чувствительность основных возбудителей инфекций к антибиотикам производства ООО "АБОЛмед" отражена в специально разработанной для практических врачей и клинических микробиологов таблице, которая содержится в рекламно-информационном каталоге фирмы.

***

Современной альтернативой диско-диффузионному методу является использование автоматизированной системы для идентификации и определения чувствительности " BD Phoenix" (производство фирмы "Becton Dickinson").
Характеристика прибора
Возможность одновременной работы со 100 образцами.
Комбинированная идентификация/определение чувствительности.
Отдельные панели для тестирования и любая их комбинация.
Надежность. Легкость в обращении. Быстрое получение результатов.
Возможность использования штрих-кодов.
Совместимость с компьютерными базами данных.
Идентификация
Более 160 видов грам (-) бактерий.
Более 145 видов грам (+) бактерий.
Нет необходимости в дополнительных тестах.
Среднее время идентификации - 3 часа!
Определение чувствительности
Двойная система индикации.
Точные значения МПК (минимальная подавляющая концентрация).
Определение сложных механизмов резистентности.
Скрининг БЛРС у всех грам (-) бактерий.
Тест на наличие бета-лактамаз в панели для идентификации и определения чувствительности всех грам (+) бактерий.
Специальный алгоритм для выявления специфических механизмов резистентности.
Выбор любого набора антибиотиков для тестирования в соответствии с потребностями.

Представительство Becton Dickinson в России
Москва, 121249, Кутузовский проспект 2/1
Гостиница Украина, офис 337. Тел.: 933 68 62. Факс: 933 68 61.
Представительство фирмы "биоМерье" в России
103287, Москва, Петровско-Разумовский проезд, д. 29, строение 2.
Тел.: 212 10 26. Факс: 214 95 41
Представительство фирмы BBL в России
Москва. Тел.: 916 77 33 и 916 76 32
Фирма Дина Интернейшнл (распространяет диски "биоМерье" и BBL)
Москва. Тел.: 323 10 01